Prognozowanie ryzyka zawału mięśnia sercowego z polimorfizmów w genach kandydackich cd

Następnie wybraliśmy 112 polimorfizmów tych genów – z których większość znajdowała się w regionach promotorowych, eksonach lub miejscach składania donorowych lub akceptorowych splicingach w intronach – które mogą powodować zmiany w funkcji lub poziomie ekspresji kodowanego białka (Tabela 1). Znaki minus przed numerowanym nukleotydem w niektórych polimorfizmach, takich jak C-535T w Tabeli 1, odnoszą się do 5 w górę regionu względem miejsca inicjacji transkrypcji genu. Genotypowanie polimorfizmów
Krew żylną (7 ml) zebrano od każdego osobnika do probówek zawierających 50 mmol EDTA na litr, i genomowe DNA izolowano z zestawem (Qiagen). Genotypy polimorfizmów 112 określono za pomocą opartego na allelu specyficznego dla allelu sondowania DNA-primer-sondy opartego na fluorescencji lub kolorymetyce (analiza Toyobo Gene) (szczegółowo opisanego w Dodatkowym dodatku 1, dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie http: //www.nejm.org). Regiony polimorficzne każdego genu były amplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z dwoma starterami sensownymi (lub antysensownymi allelowo) znakowanymi na końcu 5 albo izotiocyjanianem fluoresceiny lub czerwonym Texasem i antysensownym (lub sensownym) starterem znakowanym w Koniec 5 z biotyną. Alternatywnie, regiony polimorficzne amplifikowano z dwoma starterami sensownymi (lub antysensownymi) swoistymi dla allelu i markerem antysensownym (lub sensownym) znakowanym biotyną lub ze starterem sensownym i starterem antysensownym znakowanym biotyną. Mieszanina reakcyjna (25 .l) zawierała 20 ng DNA, 5 pmoli każdego startera, 0,2 mmol każdego trójfosforanu deoksynukleozydu na litr, do 4 mmol chlorku magnezu na litr i U polimerazy DNA (rTaq lub KODplus, Toyobo ) w odpowiednim buforze polimerazy DNA. Protokół amplifikacji obejmował początkowy okres denaturacji w 95 ° C przez 5 minut, 35 do 45 cykli denaturacji w 95 ° C przez 30 sekund, hybrydyzacji w 55 ° do 67,5 ° C przez 30 sekund, wydłużania w 72 ° C przez 30 sekund. sekund i końcowy okres wydłużania w temperaturze 72 ° C przez 2 minuty.
Aby określić genotyp za pomocą fluorescencji, inkubowaliśmy zamplifikowany DNA ze sprzężonymi ze streptawidyną perełkami magnetycznymi w 96-studzienkowych płytkach w temperaturze pokojowej. Płytki umieszczono na stojaku magnetycznym, a supernatanty przeniesiono następnie do studzienek 96-studzienkowej płytki zawierającej 10 mmol wodorotlenku sodu na litr i oceniono pod kątem fluorescencji przy długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 538 nm, w przypadek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz odpowiednio 584 i 612 nm w przypadku czerwieni Texas. W celu określenia genotypu za pomocą kolorymetrii denaturowano zamplifikowany DNA za pomocą 0,3 mola wodorotlenku sodu na litr i poddawano go hybrydyzacji w 37 ° C przez 30 minut w buforze do hybrydyzacji zawierającym 30 do 45 procent formamidu z każdym z dwóch specyficznych dla allelu wychwytów. sondy przymocowane do dna studzienek 96-studzienkowej płytki. Po dokładnym przemyciu studzienek, do każdej studzienki dodano streptawidynę sprzężoną z fosfatazą alkaliczną i płytkę inkubowano w 37 ° C przez 15 minut z jednoczesnym mieszaniem. Studzienki ponownie przemyto i po dodaniu roztworu zawierającego 0,8 mmol 2- (4-jodofenylo) -3- (4-nitrofenylo) -5- (2,4-disulfofenylo) -2H-tetrazoliowego (sól monosodowa) na litr i 0,4 mmol soli p-toluidyny 5-bromo-4-chloro-3-indolilu na litr, absorbancję próbek oceniano przy długości fali 450 nm.
Aby potwierdzić dokładność genotypowania za pomocą tej metody, losowo wyselekcjonowaliśmy 50 próbek DNA i poddaliśmy je PCR i analizie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych lub bezpośredniemu sekwencjonowaniu DNA produktów PCR.
[przypisy: badanie kwasu moczowego we krwi cena, lekarz od tarczycy, neurolog na nfz wrocław ]
[hasła pokrewne: thyrosan, komórki metaplastyczne, intubacja dotchawicza ]