Molekularny defekt prążka 3 białko w owalocytozie południowo-wschodniej Azji cd

Czerwone krwinki zostały przemyte i oznakowane jak opisano.24 Krótko, pasmo 3 było specyficznie znakowane przez inkubację nienaruszonych krwinek czerwonych z eozyną-5-maleimidem (Molecular Probes, Eugene, Oreg.). Glikoporfinę specyficznie znakowano przez koniugowanie 5-tiosemikarbazydu fluoresceiny (Molecular Probes) z ugrupowaniami kwasu sialowego połączonymi z glikoforyną. Fosfolipidowy analog fluorescein-fosfatydyloetanoloamina (Avanti Polar Lipids, Birmingham, Ala) została włączona bezpośrednio do nienaruszonych błon czerwonych krwinek. Technikę fluorescencji-fotowybielenia-odzyskiwania25 zastosowano do pomiaru bocznej ruchliwości pasma 3, glikoforyny i fluoresceiny-fosfatydyloetanoloaminy w błonach nienaruszonych czerwonych krwinek znakowanych fluorescencyjnie. W tej technice obserwuje się pojedynczą czerwoną komórkę pod mikroskopem fluorescencyjnym, z skupioną wiązką laserową jako źródłem wzbudzenia. Niewielki obszar membrany jest wystawiony na działanie krótkiego, intensywnego impulsu laserowego, powodując nieodwracalne rozjaśnienie fluoroforu. Odzyskiwanie fluorescencji, które wynika z dyfuzji bocznej nie bielonego fluoroforu do bielonego obszaru, jest mierzone. Analiza krzywych odzysku fluorescencji daje frakcję znakowanego fluorescencyjnie białka lub lipidu, który może swobodnie dyfundować w płaszczyźnie membrany (frakcja mobilna), a także współczynnik dyfuzji frakcji ruchomej.
Nasze urządzenie do fluorescencji-fotowybielenia-odzyskiwania i metody analityczne zostały opisane powyżej 24, z następującymi modyfikacjami. Za pomocą dwóch komputerowo połączonych modulatorów akustyczno-optycznych (N350850-3, Newport Electro-Optics Systems, Fountain Valley, CA) wykonano monitorowanie i fotowyświetlające impulsy laserowe. Wielokanałowy zgrzewacz (model 370, Nicolet Instrument, Madison, Wis.) Wykorzystano do zbierania danych fluorescencyjnych od dyskryminatora wzmacniacza. Eksperyment był kontrolowany przez komputer (model 386i, Sun Microsystems, Mountain View, Kalifornia) i niestandardową tablicę rozrządu (dostarczoną przez JD Corbett, VG Bose i DE Golan). Promień gaussowskiej wiązki w płaszczyźnie próbki, jak określono za pomocą dwuwymiarowej techniki skanowania emisyjnego, wynosił 0,55 p, m dla pomiarów mobilności białka i 1,86 .m dla lipidów. Moc fotowybielania na próbnej płaszczyźnie wynosiła w przybliżeniu 2 mW. Czas bielenia wynosił 300 ms dla pomiarów ruchliwości białka i 80 ms dla lipidów. Intensywność wiązki pomiarowej wynosiła w przybliżeniu 3 .W. Temperaturę próbki utrzymywano na poziomie 37 . 0,1 ° C z zastosowaniem etapu mikroskopu termicznego. Dane dopasowano za pomocą nieliniowej analizy metodą najmniejszych kwadratów, 27, jak opisano wcześniej.24
Analiza statystyczna
Ocena lod wskazująca logarytmiczną wartość prawdopodobieństwa (log odds) została oszacowana osobno dla 14 rodzin (dwóch lub trzech generacji) zgodnie z ustaloną metodą sprawdzoną przez Race and Sanger.28 Obliczono ją w następujący sposób: prawdopodobieństwo obserwowania współistnienia owalocytoza i nieprawidłowość pasma 3, która została uznana za genetycznie powiązaną, została podzielona przez prawdopodobieństwo zaobserwowania współistnienia owalocytozy i nieprawidłowości w zespole 3, która nie była powiązana genetycznie. Połączenie autosomalne uważa się za ustalone, jeżeli suma wyników lod w rodzinach osiąga 3 (szanse na połączenie, 1000: 1).
Inne metody
Zastosowano również następujące wcześniej opisane metody: stężenie białka29; wiązanie spektyny znakowanej 125I do wewnętrznych pęcherzyków30; elektroforeza błonowo-białkowa zgodnie z metodami Fairbanks et al.31 i Laemmli, 20, po której następuje oznaczenie ilościowe pasm białka przez śledzenie densytometryczne; samoasocjacja dimer dimeru spektryny w roztworze32; interakcja spektryny, aktyny i zespołu 4.133; indukowane ciepłem sieciowanie spektryny po inkubacji przemytych krwinek czerwonych w temperaturze 46 do 52 ° C przez 30 minut34; i tryptyczne trawienie spektrum.35
Wyniki
Odporność na wywołane solą zmiany w kształcie
Rysunek 2
[hasła pokrewne: podwyższone ggtp, komórki metaplastyczne, intubacja dotchawicza ]