Molekularny defekt prążka 3 białko w owalocytozie południowo-wschodniej Azji ad

Membrany ducha zostały przygotowane z przemytych erytrocytów metodą Dodge i wsp., 17 z 5 mM fosforanem sodu (pH 7,4). Szkielety spektryny-aktyny (lub muszle Triton) wytworzono przez ekstrakcję lipidów i integralnych białek błonowych z duchów za pomocą 1% Triton X-100 w buforze fosforanowym (pH 7,4) w 0 ° C przez 30 minut. Chlorek sodu (stężenie końcowe, 150 mM) dodano do świeżo przygotowanych upiorów lub muszli Triton w temperaturze 0 ° C w celu zainicjowania wywołanych solą zmian kształtu, charakteryzujących się tworzeniem spikul powierzchniowych. Po 10-minutowym okresie inkubacji, duchy lub muszle Triton zostały utrwalone aldehydem glutarowym i zbadane za pomocą mikroskopu świetlnego z kontrastem fazowym podłączonego do kamery Newvicon i monitora wideo (MTI, Michigan City, Ind.). Wykrywanie nieprawidłowości strukturalnych białka pasmowego 3 za pomocą ograniczonej proteolizie
Duchy erytrocytów zawieszono w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) i trawiono N-tosylo-L-fenyloalaniną, chlorometylo-ketonem-trypsyną (1: 250 do 1: 2000 wag./wag.) Przez trzy, sześć i dziewięć godzin w 0 ° C. DO. Reakcję zakończono przez dodanie inhibitora proteazy, fluorofosforanu diizopropylu (1 mM) lub przez ogrzewanie próbek do 100 ° C przez jedną minutę w obecności 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 20 mM ditiotreitolu.
W równoległym eksperymencie, membrany zubożone w spektrynę, aktynę (prążek 5) i dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (prążek 6) przygotowano przez ekstrakcję tych białek z normalnych i drożdżowych błon bojowych, jak opisano wcześniej.19 Membrany te trawiono papainą (1 do 10 .g na mililitr) przez jedną godzinę w 23 ° C, 19 ° C i reakcję zakończono jodooctanem sodu (stężenie końcowe, 10 mM). Próbki poddawano elektroforezie w obecności SDS, jak opisano poniżej.
Elektroforeza białek i immunoblotting
Błonnik białkowy poddano elektroforezie na żelach SDS-poliakryloamid (12%) lub w gradiencie SDS-poliakryloamid (15 do 25%) w procesie Laemmli. Do analizy immunochemicznej metodą blottingu Western, żele elektroforetycznie przenoszono na bibułę nitrocelulozową; sondowano poliklonalnymi króliczymi przeciwciałami anty-pasmowymi 3 (dar dr Manjit Hanspal i Rajiv Kalraiya), domeną anty cytoplazmatyczną przeciwciał 3 pasma (dar pani Catherine Korsgren) lub surowicą odpornościową na peptydy odpowiadające resztom 142 do 154 erythroid band 321 (prezent Dr. Philip S. Low); i potraktowane drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z peroksydazą, a następnie rozwój barwny po dodaniu 3,3 -diaminobenzydyny.
Interakcja Ankyrin z domeną cytoplazmatyczną białka Band 3
Zastosowano dwa podejścia do badania interakcji ankyryny z domeną cytoplazmatyczną białka 3 pasma. Pierwszy obejmował badanie wiązania oczyszczonej, znakowanej radioaktywnie ankiryny z wewnętrznymi pęcherzykami błonowymi zawierającymi białko pasma 3, ale pozbawioną ankyryny23. Alternatywnie, wiązanie ankyryny z domeną cytoplazmatyczną prążka 3 mierzono bezpośrednio w roztworze. Rozpuszczalną w wodzie 41 000 i 43 000 daltonowej domeny cytoplazmatycznej prążka 3 wytworzono przez proteolizę wewnętrznych pęcherzyków (uprzednio pozbawionych ankyryny) za pomocą .-chymotrypsyny i oczyszczono w natywnej postaci metodą chromatografii kolumnowej z użyciem DE-52. celuloza (Whatman, Maidstone, Wielka Brytania) i Ultrogel AcA-44 (LKB, Gaithersburg, Md.), jak opisano poprzednio.23. Stwierdzono wiązanie ankyryny do domeny cytoplazmatycznej zespołu 3, 23 przy stałym stężeniu pasma. 3 fragmenty i zmienne stężenia ankyryny w mieszaninach reakcyjnych.
Badania lateralnej mobilności prążków 3 w błonie komórkowej
Krew żylną od jednego pacjenta z owalocytozą i jedną normalną kontrolę zebrano w kwas-cytrynian-dekstroza i wysłano w ciągu nocy do Bostonu do natychmiastowego przetworzenia
[patrz też: xarelto zamienniki, intubacja dotchawicza, rak nosogardła ]