Molekularny defekt prążka 3 białko w owalocytozie południowo-wschodniej Azji ad 8

Wyizolowane 125I ankiryny i pozbawione aniryny pęcherzyki zostały wytworzone z normalnych kontroli. Domena cytoplazmatyczna prążka 3 została przygotowana z pęcherzyków z owalocytów i kontrolnych krwinek czerwonych za pomocą trawienia chymotrypsyną. 23 ankyrinę znakowaną 125I (3 .g) inkubowano z pęcherzykami (15 .g białka błonowego) przy różnych stężeniach domeny cytoplazmatycznej zespołu 3 (2,5 do 20 .g) przez cztery godziny w 0 ° C. Należy zauważyć, że fragment pasma 3 wytworzony z owalytów zahamował wiązanie ankyryny do pozbawionych aniryny wewnątrzkomórkowych pęcherzyków bardziej niż fragment kontrolnego pasma 3. Panel C pokazuje wiązanie ankyryny z domeną cytoplazmatyczną prążka 3 w roztworze. Zbadaliśmy wpływ wzrastającego stężenia ankiryny znakowanej 125I na wiązanie ankyryny z domeną cytoplazmatyczną w paśmie 3. Znakowana 125I ankyrina została przygotowana z normalnych erytrocytów. Domena cytoplazmatyczna prążka 3 została przygotowana z komórek zdrowych kontrolnych i osobników z owalocytozą. Wyznakowany 125I ankyrin (1 do 8 x 10-7 M) inkubowano przez trzy godziny w 0 ° C w 0,2 ml roztworu zawierającego 8 .g domeny cytoplazmatycznej zespołu 3. Wiązanie zmierzono po immunoprecypitacji kompleksów z anty-pasmowy 3 IgG i gronkowce zawierające białko A. Niespecyficzne wiązanie pochodzące z anaturiny znakowanej 125I denaturowanej ciepłem odjęto. Specyficzne wiązanie ankyryny z domeną cytoplazmatyczną prążka 3 skorygowano o szybkość odzyskiwania domeny cytoplazmatycznej prążka 3 przez bakterie. Wstawka pokazuje wykres Scatcharda wolnej (F) i związanej (B) ankyryny otrzymanej z danych wiązania. Należy zauważyć, że normalna ankyrina wiąże się bardziej z segmentem cytoplazmatycznym prążka 3 pochodzącym z owalytów, niż z kontrolnymi krwinkami czerwonymi. Po stwierdzeniu zmian strukturalnych domeny cytoplazmatycznej białka pasmowego 3 w owalocytozie, następnie zbadaliśmy funkcję tego białka pod względem jego wiązania z ankyriną. Do tych eksperymentów przygotowaliśmy odśrodkowe pęcherzyki błonowe pozbawione ankyryny. Ze względu na ich orientację na lewą stronę, region wiążący ankyrinę białka pasma 3 eksponowano na zewnętrznej powierzchni pęcherzyków. Figura 6A pokazuje, że pęcherzyki wytworzone z owalocytów wiążą znacznie większe ilości znakowanej 125I ankyryny niż odpowiednie kontrole. Wiązanie ankyryny zostało niemal całkowicie zniszczone przez preinkubację w temperaturach wyższych niż 60 ° C (dane nie przedstawione).
Stwierdzenie, że więcej ankiryn związanych z pęcherzami poza owalocytem niż z normalnymi pęcherzykami było dodatkowo poparte stwierdzeniem, że rozpuszczalne w wodzie fragmenty 40 000- i 43 000-daltonów (reprezentujące domenę cytoplazmatyczną zespołu 3) wytworzono z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych owalnych hamowały wiązanie wyznakowanej 125I ankyryny do normalnych pęcherzyków z wewnętrznymi pęcherzykami pozbawionymi ankyry znacznie bardziej niż normalne fragmenty pasm 3 o wielkości 40 000 i 43 000 daltonów (Fig. 6B). Bezpośrednio oceniliśmy również specyficzne wiązanie ankyryny z izolowaną domeną cytoplazmatyczną opaski 3 przygotowaną od osobników z owalocytozą lub kontrolami (Fig. 6C). Stechiometryczny stosunek wiązania był wyższy u osób z owalocytozą niż w grupie kontrolnej (mole ankyryny na mol domeny cytoplazmatycznej zespołu 3, 0,54 vs
[hasła pokrewne: thyrosan, quizwanie premium chomikuj, taromentin opinie ]