Molekularny defekt prążka 3 białko w owalocytozie południowo-wschodniej Azji ad 5

Ograniczona trawienie tryptyczne i immunoblotting kontrolnych erytrocytów (C) i owalu (Ov) Ghosts. W Panelu A, świeżo przygotowane kontrole erytrocytów i owalocytu zostały zawieszone w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) i potraktowane trypsyną (1: 250, wag./wag.) W 0 ° C. Ograniczone trawienie tryptyczne przerwano po trzygodzinnej inkubacji; próbki poddawano elektroforezie na żelach SDS-poliakrylamidowych zgodnie z metodą Laemmli ego 20 i barwiono błękitem Coomassie. Przedstawiono trawienie duchów z normalnych erytrocytów i reprezentatywnych próbek owalnych. Zauważ, że trawienie trypsyną obu próbek wytworzyło znaczące 22 000-daltonowe pasmo. Ponadto, próbka owalu zawierała nieprawidłowy peptyd o wielkości 25000 daltonów. Panel B pokazuje immunoblot trawionych duchów z króliczym przeciwciałem skierowanym przeciwko oczyszczonej domenie cytoplazmatycznej zespołu 3. Zauważ, że zarówno peptydy o 22000 daltonach jak i 25 000 daltonach reagowały z przeciwciałami przeciw domenie cytoplazmatycznej zespołu 3. Panel C pokazuje immunoblot rozpuszczalne w wodzie fragmenty uwolnione z pasma 3 przez trypsynę. Normalne i owalne pęcherzyki błonowe (4 mg na mililitr) pozbawione pasm 1, 2, 5 i 6 inkubowano przez godzinę w 5 mM buforze fosforanowym (pH 8,0) z trypsyną (40 .g na mililitr) w 0 ° C. Trawienie zakończono fluorofosforanem diizopropylu. Frakcję supernatantu zebraną po 30-minutowym odwirowaniu analizowano za pomocą 15 do 25% elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, przeniesiono na nitrocelulozę i poddano immunoblottingowi z surowicą odpornościową przeciwko peptydom odpowiadającym resztom 142 do 154 ludzkiego pasma erytroidalnego 3.21. Trawienie uwolniło normalne 22 000 -dalton i nienormalne fragmenty 25 000 Daltonów z błon. Panel D pokazuje immunoblot trawienia papainą rozpuszczalnych w wodzie 22000- i 25000-daltonowych fragmentów. Porcję supernatantu (Panel C) nie poddanego działaniu fluorofosforanu diizopropylu ponownie trawiono papainą (10 ug na mililitr) w 23 ° C przez jedną godzinę i analizowano jak opisano powyżej. Należy zauważyć, że nienormalny fragment o wielkości 16 000 Daltonów został wykryty w próbce pobranej z krążka owalnego, zawierającej nienormalny fragment o wielkości 25000 Daltonów. Panel E pokazuje barwienie rozpuszczalnych w wodzie fragmentów uwalnianych z pasma 3 przez papainę. Błony pęcherzykowe zubożone w pasmach 1, 2, 5 i 6 inkubowano przez godzinę w 5 mM buforze fosforanowym (pH 8,0) z papainą (1 ug na mililitr) w 23 ° C. Trawienie zakończono jodooctanem. Supernatant analizowano za pomocą elektroforezy żelowej w 12% poliakryloamidzie, a następnie barwieniu błękitem Coomassie. Zauważ, że pasmo owalne 3 uwolniło nieprawidłowy fragment 43 000 Daltonów oprócz normalnego fragmentu 40 000 Daltonów. Panel F pokazuje papę czerwoną z rozpuszczalnych w wodzie 40 000- i 43 000-daltonowych fragmentów. Część supernatantu (Panel E) nietraktowana jodooctanem została ponownie strawiona papainą (10 .g na mililitr) w 23 ° C przez jedną godzinę i analizowana jak opisano powyżej. Zauważ, że wysokie stężenie papainy spowodowało cięcie fragmentu 9000-daltonów z rozpuszczalnych w wodzie fragmentów o rozmiarze 40 000 i 43,000 daltonów. Nieprawidłowy fragment 34 000-daltonów wykrywano w dodatku do normalnego fragmentu 31000-daltonów w próbce pobranej z przeszczepu owalnego
[więcej w: quizwanie premium chomikuj, nabłoniak, quizwanie premium chomikuj rejestracja ]